固氮酶进行催化作用将N2还原为NH3，需要电子、质子、MgATP。固氮微生物细胞中主要电子供体有丙酮酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和其磷化合物、H2和甲酸等。在生化研究中常用连二亚硫酸做电子供体。它们提供的电子首先先传递给电子载体，主要有铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白。而后电子载体将电子转移给固氮酶的铁蛋白，进而被还原了的铁蛋白将电子转移给钼铁蛋白，最后被还原了的钼铁蛋白将电子用于底物的还原，完成固氮酶的催化过程，步骤如下：
经过上列步骤固氮酶完成一次周转，讲一个电子转移给底物。N2还原为NH3需要多个电子，由固氮酶多次周转来完成。接受了电子的钼铁蛋白如何还原底物，其途径尚不很清楚，它的FeMoco被认为是N2还原的活性中心，N2首先同Mo结合，每次接受1个电子和1个H+，可能经过如下步骤被还原为2NH3。
氮是氮气还原的产物，没有发现过游离的中间产物，但已证明存在酶缚中间产物联胺，酶 联胺接受电子和质子释放出氮。图13-3示固氮酶催化过程。
图13-3也表明氢是N2还原的竞争性抑制剂，而H2的形成又是N2还原过程中的必然产物，即使在50大气压N2下也不可能避免放H2。在每分子N2还原过程中，形成2NH3需要6个电子，形成1H2需2个电子。同时每转移一对电子需要4分子ATP，即12ATP用于2NH3的形成，4ATP用于1H2的形成，共消耗16ATP。固氮作用所需电子和ATP的数量如下式所示：
葡萄糖进行完全氧化磷酸化时，每队电子产生3个ATP，1分子葡萄糖产生38分子ATP。上列反应式（Ⅰ）中对电子相当于9分子ATP，所以还原1分子N2共需要21分子ATP；反应式（Ⅱ）中1对电子相当于3分子ATP，所以形成1分子H2共需7分子ATP。两项反应共需28分子ATP，约相当于消耗0.74分子葡萄糖。也就是说每固定1克分子N2需要消耗约53克分子C。因生物种类和条件不同，分解葡萄糖时产生ATP的效率不一样，转移每对电子所需要的ATP数量不同。所以各种固氮体系还原分子N2时消耗的碳水化合物差异很大。形成的H2是否在细胞内被再利用，对能量的需要情况有影响。
