垂花蕙兰丛生芽途径的组织培养技术

垂花蕙兰系以花葶下垂的多花兰、硬叶吊兰、紫纹兰、湿地兰、沟唇兰、地旺兰等为亲本与大花蕙兰杂交产生的后代，花多色艳，开花期长达30-60天，该花虽然繁殖系数高，但是再生植株容易出现变异，本实验从无菌材料获得不同浓度6-BA 对丛生芽诱导和增殖的影响，主要是为了建立垂花蕙兰丛生芽增殖途径的离体快繁技术体系，接下来耕种帮就来详细说说。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用材料来自三明市农科院花卉研究所垂花蕙兰。
1.2 方法
1.2.1 无菌材料获得
材料的预处理：在取侧芽之前要进行消毒，可以采取以下措施：
采用温室栽培母株、定期给母株喷洒1000 倍50%甲基托布津药液、在春季晴天上午取材、尽量取高于栽培基质的侧芽。
侧芽的表面消毒：用手术刀采取饱满叶片尚未展开的侧芽，切去根后用自来水冲洗20分钟，转入净化工作台，可采用以下四种方法进行表面消毒：
A：用0.1%的升汞溶液处理10min，用无菌水冲洗3-4 次，无菌滤纸吸干，再剥去外面1-2片叶，接种到诱导培养基上培养。
B：先用72%乙醇浸泡30s，然后用0.1%的升汞溶液处理10min，用无菌水冲洗3-4 次，无菌滤纸吸干，再剥去外面1-2 片叶，接种到诱导培养基上培养。
C：先用72%乙醇浸泡30s，然后用0.1%的升汞溶液处理8min，用无菌水冲洗3-4 次，剥去外面1-2 片叶，再用15%的次氯酸钠溶液处理4min，无菌水冲洗3-4 次，无菌滤纸吸干，接种到诱导培养基上培养。
D：先用72%乙醇浸泡30s，然后用15%的次氯酸钠溶液处理10min，用无菌水冲洗3-4次，无菌滤纸吸干，再剥去外面1-2 片叶，接种到诱导培养基上培养。
不同取材季节对侧芽消毒效果的影响：分别在春季3月、夏季6月和秋季9月采取侧芽，进行表面消毒处理后接种到诱导培养基上培养。观察不同取材季节对侧芽消毒的影响，以上诱导培养基均为1/2MS+6-BA4.0 mg· L-1+NAA0.1 mg · L-1+AC0.5 g · L-1。
1.2.2 丛芽的诱导培养
选取健壮、无病虫害、叶片尚未完全展开的垂花蕙兰侧芽，采用消毒方法C进行表面消毒处理，将消毒好的腋芽接种到6-BA 浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0 mg · L-1诱导培养基1/2MS+NAA0.1mg · L-
1+AC0.5 g· L-1 上进行丛生芽的诱导，观察不同浓度6-BA 对丛生芽诱导影响。
1.2.3 丛芽的增殖培养
将诱导获得的无菌芽接种到培养基1/2MS+6-BA4.0 mg · L-1+NAA0.1 mg · L-1+AC0.5 g·L-1 上继代培养3 次后获得足够的材料，然后接种到到6-BA 浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0 mg · L-1 增殖培养基1/2MS+NAA0.1mg· L-1+AC0.5 g · L-1 上进行增殖培养，观察不同浓度6-BA 对丛生芽增殖的影响。
1.2.4 生根与壮苗培养
以大量元素减半的1/2MS 为基本培养基，设置NAA、香蕉泥和AC3 因素和3 水平，NAA水平1、2、3 分别为0.5、1.0、2.0 mg · L-1，香蕉泥水平1、2、3 分别为0、30、50 g · L-1，AC 水平1、2、3 分别为0.5、1.0、2.0 g· L-1，每处理接种2 瓶，每瓶10 株无根苗，重复3 次。
1.2.5 炼苗移栽
将生根好的试管苗放在温室大棚炼苗4天，揭开瓶盖继续炼苗3天后用镊子小心取出试管苗洗去根部的培养基，把苗全部浸入800 倍的甲基硫菌灵药液10分钟后，捞起自然晾干后，移栽到苔藓、细小轻木颗粒、泥炭土、菜园土和泥炭：菜园土=1:1 基质中，放置在温室大棚中养护，保持湿度80%左右，温度16-28℃，同时定期喷晒100倍的MS培养基大量元素和800 倍70%甲基托布津药液，大约60天后统计苗的成活率。
1.2.6 培养条件
培养温度25±1℃,每天光照12h,光照强度2000lx,培养基均添加蔗糖30 g · L-1，pH5.6。
1.2.7 统计分析方法
污染率=(污染的外植体数/接种外植体数)×100%；褐化率=(褐化的外植体数/接种外植体数)×100%；死亡率=(死亡外植体数/接种外植体数)×100%；成活率=(未褐化成活的外植体数/接种外植体数)×100%；启动率=(启动外植体数/存活外植体数)×100%；生根率=(生根的苗数/接种的苗数)×100%；芽增殖系数=统计时芽数/接种时芽数；平均根数=生根总数/接种苗数；移栽成活率=(成活苗数/移栽苗数)×100%。用DPS 数据处理软件进行试验数据统计和分析，EXCEL 软件进行制表和绘图。
2 结果与分析
2.1 无菌材料获得
2.1.1 消毒方法对侧芽成活率的影响
由图1 可以看出，四种不同消毒方法中，D方法侧芽污染率最高，为69%，其次为A 方法和B方法,C方法污染率最低；而对于死亡率，D方法死亡率最低，仅为12%，其次是A 方法和C 方法,而B 方法侧芽死亡率最高；从成活率来看，C方法侧芽存活率最高56%，其次是A方法和B 方法,D 方法存活率最低，通过这些数据可知，升汞消毒效果比次氯酸钠好，三次消毒比一次、二次消毒效果好。
2.1.2 不同取材季节对侧芽消毒的影响
由表1 可知，三个不同取材季节中，夏季取材侧芽污染率最高为32%，其次是秋季为30%，春季侧芽污染率最低为22%；而对于褐化和死亡情况，秋季最高，其次是夏季，春季最低；从成活率来看，春季取材侧芽成活率最高达54%,其次是夏季，为38%，最低的是秋季，仅为36%。试验还发现，春季和夏季取材，侧芽启动时间短，生长速度快；而秋季取材，侧芽启动时间长，生长缓慢。因此耕种帮建议垂花蕙兰侧芽最佳取材季节是春季。
图1 四种消毒方法对侧芽成活率的影响

2.2 丛生芽的诱导
由表2 可见，当6-BA 浓度为0.5 mg · L-1 时，丛生芽诱导启动率最低，仅为47.1%。当6-BA浓度为4.0mg·L-1 时，丛生芽诱导启动率最高达100%。6-BA 浓度在0. 5-4.0 mg · L-1 范围之间，垂花蕙兰丛生芽启动率随6-BA 浓度增加而提高。6-BA 浓度在0. 5-2.0 mg · L-1 之间，芽分化较少。6-BA 浓度为4.0mg · L-1 时，芽分化较多。因此耕种帮建议4.0 mg · L-16-BA 适合丛生芽诱导。

2.3 丛芽的增殖培养
由表3 可看出，当6-BA 为6.0mg · L-1 时，丛生芽增殖倍数最大，为4.1。当6-BA 浓度为在2.0-6.0mg · L-1之间，丛生芽数随其浓度增大而提高。但当6-BA 为8.0 mg · L-1 时，丛生芽增殖系数降至3.2。丛生芽质量随着6-BA 浓度增大逐渐由健壮变为纤弱。适当提高6-BA 浓度有利于丛生芽的增殖，浓度过高，则抑制丛生芽的增殖。综合考虑，本试验6-BA浓度4.0mg·L-1 适合丛生芽增殖。

2.4 生根与壮苗培养
由生根率方差分析(表5)可知，NAA 对丛芽增殖苗生根率影响极显著，香蕉泥对生根率影响显著，而活性碳对生根率影响不显著。说明NAA 是影响生根率最主要因素。香蕉泥对试管的生根率也有促进作用。由生根数方差分析(表5)可知，NAA 和香蕉泥对丛生芽增殖苗生根条数有极显著影响，活性炭显著影响生根数。比较NAA 和香蕉泥的F 值可知，NAA 是影响丛生芽增殖苗生根的最主要因素，其次香蕉泥，再次是活性炭。对NAA、香蕉泥和活性碳各水平进行多重比较见表6。

由表6 可知，NAA三水平间，NAA水平3（2mg·L-1）的生根率和平均根数与水平1（0.5mg · L-1）、水平2（1 mg · L-1）差异极显著，水平2（1 mg · L-1）与水平1（0.5 mg · L-1）差异也极显著。可以说明，在0.5-
2.0mg · L-1 浓度范围，生根率和平均根数随NAA 浓度升高而升高。NAA 浓度为2.0mg · L-1 时，生根率最高，平均根数也最多。
由表6 可以看出，香蕉泥三水平间，水平3（50 g · L-1）生根率与水平1（0 g · L-1）差异显著，水平3（50 g · L-1）与水平2（30 g · L-1）、水平1（0 g · L-1）与水平2（30 g · L-1）差异不显著。三水平之间
的平均根数差异极显著。说明，添加一定量的香蕉泥能促进根的生长，本试验香蕉泥浓度为50 g · L-1 时，生根效果最好。
由表6 可知，AC 三水平的生根率差异不显著。水平2（1 g · L-1）平均根数与水平1（0.5g · L-1）、水平3（2 g · L-1）差异显著。平均生根数随着AC 浓度升高先升高后降低，本试验AC 浓度为1 g · L-1 时，生根培
养效果最好。
综上所述，适宜垂花蕙兰丛生芽苗生根培养基配方为1/2MS+NAA2.0 mg · L-1+香蕉泥50 g · L-1+AC1 g · L-1。

2.5 炼苗和移栽
由表7 可看出，五种基质中，以苔藓为最好，成活率可达100%，苗生长健壮，叶片浓绿富有光泽；其次是细小轻木颗粒，成活率为86%，苗生长较好，叶片黄绿根系发达；泥炭土移栽效果一般，成活率也只有68%；移栽效果最差的基质是菜园土，成活率为54%，苗呈萎蔫状，不生长。可见，本试验垂花蕙兰瓶苗移栽最佳基质是苔藓。